本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其在合成甜菊糖苷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、甜菊糖苷是一種從甜葉菊提取的天然高倍甜味劑，具有安全食用、低熱量和穩(wěn)定性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品和制藥等行業(yè)。甜菊糖的化學(xué)多樣性體現(xiàn)在其二萜甜菊糖骨架在c13-羥基和/或c19-羧酸位置上與一至三個葡萄糖基結(jié)合。甜菊糖苷（st，含3個β-糖基）和甜菊糖苷a（reba，含4個β-糖基）是主要成分，而甜菊糖苷d（rebd，含5個β-糖基）和甜菊糖苷m（rebm，含6個β-糖基）則是次要成分，因為含量低，所以提取法制備時難度大，產(chǎn)量低，不能滿足市場需求。
2、甜菊糖苷d是一種極具應(yīng)用前景的甜菊糖苷甜度比蔗糖高200-300倍，但其攜帶的短暫后苦味影響了其在市場的應(yīng)用與推廣。甜菊糖苷m的甜度約為蔗糖的300-400倍，幾乎無后苦味，并具有潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值，使得甜菊糖苷m的市場應(yīng)用更廣；現(xiàn)有的甜菊糖苷m的制備方法中已經(jīng)有利用糖基轉(zhuǎn)移酶偶聯(lián)蔗糖合酶催化合成甜菊糖苷m的報道，但常以溶解性較差的甜菊糖苷d為底物進行催化，因此限制了甜菊糖苷m的高效生產(chǎn)。
3、甜菊糖苷m2是在甜菊糖苷d的c19位連接的第一個葡萄糖基的c-6’位添加一個葡萄糖基，相比于甜菊糖苷d，甜菊糖苷m2的甜度增加，后苦味消失。因此，甜菊糖苷m2比甜菊糖苷d具有更好的糖特性和更理想的味道。甜菊糖苷m2可以通過糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用從甜菊糖苷d生成，也同樣存在產(chǎn)量低,易生成副產(chǎn)物等缺陷。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是：提供一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，通過對糖基轉(zhuǎn)移酶原始序列的氨基酸進行單點及組合突變，得到高效、穩(wěn)定的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，并將該突變體克隆到重組質(zhì)粒中、轉(zhuǎn)化到重組菌體中進行甜菊糖苷d的生產(chǎn)。
2、本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是：提供一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的應(yīng)用，利用pgugt突變體與蔗糖合酶atsusy偶聯(lián)，并與atsusy-76g4構(gòu)建級聯(lián)反應(yīng)體系，催化reba生成rebm。
3、本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是：提供一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的應(yīng)用，利用pgugt突變體與蔗糖合酶atsusy偶聯(lián)，并與atsusy-ntugt-m8構(gòu)建級聯(lián)反應(yīng)體系，催化reba生成rebm2。
4、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
5、一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，由氨基酸序列如seq?id?no.1（panax?ginseng,?proteinid:?aka44579.1）制造四個單點突變獲得，所述單點突變是將seq?id?no.1氨基酸序列中的c41i（中間數(shù)字41代表突變位點位置，后面的位點突變相同表示）由半胱氨酸（c）突變成異亮氨酸（i）、a140s由丙氨酸（a）突變成絲氨酸（s）、n283p由天冬酰胺（n）突變成脯氨酸（p）、a342l由丙氨酸（a）突變成亮氨酸（l）；
6、并利用單點突變制備出c41i+n283p（雙位點突變）、c41i+a140s+n283p（三位點突變）和c41i+a140s+n283p+a342l（四位點突變）的突變體；
7、突變后的氨基酸序列見seq?id?no.2至seq?id?no.8。
8、一種重組質(zhì)粒a，由含有上述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的核苷酸序列連接到含有蔗糖合酶基因（擬南芥蔗糖合酶atsusy的原始序列）的petduet-1載體質(zhì)粒上制得。
9、一種重組質(zhì)粒b，由含有上述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的核苷酸序列連接到含有蔗糖合酶基因（擬南芥蔗糖合酶atsusy的原始序列）的pcdfduet-1載體質(zhì)粒上制得。
10、一種重組質(zhì)粒c，由含有糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g4的基因（見seq?id?no.9，公開于專利cn119265154a（2024.13.10），一種糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g4突變體及其應(yīng)用）連接到含有蔗糖合酶基因的prsfduet-1載體質(zhì)粒上制得。
11、一種重組質(zhì)粒d，由含有糖基轉(zhuǎn)移酶ntugt-m8的基因（見seq?id?no.10，公開于cn119220515a（2023.06.30），一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其催化合成萊鮑迪苷m2的方法）連接到含有蔗糖合酶基因的prsfduet-1載體質(zhì)粒上制得。
12、一種重組菌及其應(yīng)用，將重組質(zhì)粒a、重組質(zhì)粒a和重組質(zhì)粒c、重組質(zhì)粒b和重組質(zhì)粒d分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（escherichia?coli）bl21（de3）菌株，并將其分別應(yīng)用到催化合成甜菊糖苷d、甜菊糖苷m、甜菊糖苷m2的生產(chǎn)中。
13、由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：
14、1、本發(fā)明構(gòu)建的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，酶活得到顯著提高，尤其是多位點聯(lián)合突變的突變體c41i+a140s+n283p+a342l的酶活提高最為顯著，其純酶的相對酶活為原始糖基轉(zhuǎn)移酶的2.7倍；且熱穩(wěn)定性也得到顯著提升，在40℃孵育3h，酶活保持穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性得到顯著改善，而現(xiàn)有技術(shù)中的原始糖基轉(zhuǎn)移酶，在40℃下孵育3h，酶活僅保持37.69%。
15、2、本發(fā)明通過將糖基轉(zhuǎn)移酶突變體連接到含有蔗糖合酶基因的petduet-1載體質(zhì)粒上制得重組質(zhì)粒a；將糖基轉(zhuǎn)移酶突變體連接到含有蔗糖合酶基因的pcdfuet-1載體質(zhì)粒上制得重組質(zhì)粒b；將含有糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g4的基因連接到含有蔗糖合酶基因的載體質(zhì)粒上制得重組質(zhì)粒c；將含有糖基轉(zhuǎn)移酶ntugt-m8的基因連接到含有蔗糖合酶基因的載體質(zhì)粒上制得重組質(zhì)粒d；然后將重組質(zhì)粒a與重組質(zhì)粒c一起轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達用于催化甜菊糖苷a生成甜菊糖苷m，將重組質(zhì)粒b與重組質(zhì)粒d一起轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達用于催化甜菊糖苷a生成甜菊糖苷m2。這樣就可以實現(xiàn)直接從甜菊糖苷合成甜菊糖苷m或者甜菊糖苷m2，合成方法條件溫和，操作簡單，時間短，催化效率高，產(chǎn)率高，具有較好的應(yīng)用前景。
1.一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，由氨基酸序列seq?id?no.1制造四個單點突變獲得，所述單點突變是將seq?id?no.1氨基酸序列中的c41i由半胱氨酸突變成異亮氨酸、a140s由丙氨酸突變成絲氨酸、n283p由天冬酰胺突變成脯氨酸、a342l由丙氨酸突變成亮氨酸；
2.一種重組質(zhì)粒a，其特征在于，由含有權(quán)利要求1制備的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的核苷酸序列連接到含有蔗糖合酶基因的petduet-1載體質(zhì)粒上制得。
3.一種重組質(zhì)粒b，其特征在于，由含有權(quán)利要求1制備的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的核苷酸序列連接到含有蔗糖合酶基因的pcdfduet-1載體質(zhì)粒上制得。
4.一種重組菌，其特征在于：將權(quán)利要求2得到的重組質(zhì)粒a轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21（de3）菌株制得。
5.一種重組菌，其特征在于，將重組質(zhì)粒c和權(quán)利要求2得到的重組質(zhì)粒a共同轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21（de3）菌株制得，所述重組質(zhì)粒c是由含有糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g4的基因連接到含有蔗糖合酶基因的prsfduet-1載體質(zhì)粒上制得。
6.一種重組菌，其特征在于：將重組質(zhì)粒d和權(quán)利要求3得到的重組質(zhì)粒b共同轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21（de3）菌株制得，所述重組質(zhì)粒d是由含有糖基轉(zhuǎn)移酶ntugt-m8的基因連接到含有蔗糖合酶基因的prsfduet-1載體質(zhì)粒上制得。