本發(fā)明涉及細胞工程與基因工程領域，具體涉及一種marc145細胞的改造方法。
背景技術：
1、marc145細胞系源自猴成纖維細胞系?ma104，因其對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（prrsv）具有較高的敏感性，常被用于prrsv的相關研究，是體外研究prrsv感染機制、病毒復制以及評估抗病毒策略等方面的重要細胞模型。但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，野生型的marc145細胞對prrsv病毒的敏感性及病毒顆粒釋放效率有限，制約了疫苗生產與病毒研究，需要進一步的優(yōu)化。
2、通過基因工程技術改造marc145細胞的前景雖然展現(xiàn)出巨大的潛力，但在實際應用中仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。如通過敲除tbk1基因可以提高?marc145細胞對某些prrsv毒株的復制能力，然而，這種基因改造可能會帶來其他潛在的風險，如細胞功能的改變或對其他病毒的敏感性增加；rnai技術可以抑制病毒復制，但可能影響細胞的正常功能。由此看來，盡管基因工程技術可以提供多種改造marc145細胞的手段，但其改造方法仍需進一步優(yōu)化。
技術實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種marc145細胞的改造方法。
2、本發(fā)明的目的在于提供一種marc145細胞。
3、為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
4、一種marc145細胞的改造方法，所述改造方法是采用慢病毒載體介導多基因共表達的方式改造marc145細胞，所述基因包含marc145細胞的cd151基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒prrsv的nsp2基因和nsp11基因，所述cd151基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述nsp2基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述nsp11基因的核苷酸序列如seq?idno.3所示。
5、一種采用所述的改造方法改造的marc145細胞系。
6、一種擴繁prrsv病毒的方法，采用所述的marc145細胞系擴繁prrsv病毒。
7、一種所述的marc145細胞系在研究病毒致病機制與制備新型疫苗中的應用。
8、優(yōu)選的，所述慢病毒載體介導多基因共表達的方式包含以下步驟：
9、s1.?采用慢病毒載體分別與marc145細胞的cd151基因、prrsv的nsp2基因和nsp11基因連接，轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得三個重組慢病毒質粒；
10、s2.?分別將三個重組慢病毒載體質粒與包裝質粒按一定比例混合，共轉染293t細胞，獲得三個包裝后的重組慢病毒；
11、s3.?采用步驟s2獲得的慢病毒毒液感染marc145細胞，并加入8μg/ml?聚凝胺，感染12h，更換為新鮮dmem+10%fbs培養(yǎng)基；
12、s4.?感染72小時后，加入2μg/ml嘌呤霉素篩選?2?周，傳代3-5次至生長穩(wěn)定，獲得改造后的陽性克隆，凍存。
13、優(yōu)選的，所述慢病毒載體為plv41tr-puro-cmv。
14、優(yōu)選的，步驟s2所述包裝質粒為pspax2、pmd2.g。
15、一種所述的三個重組慢病毒質粒在提高病毒prrsv感染敏感性中的應用。
16、相較于原有技術，現(xiàn)在發(fā)明的有益效果是：
17、本發(fā)明提供了能夠有效提高細胞對prrsv敏感性的三個質粒，具有廣譜適用性。其中plv41tr-puro-cmv-cd151，除prrsv外，對依賴?cd151?受體的其他病毒（如登革病毒）亦有增殖促進作用，plv41tr-puro-cmv-nsp2、plv41tr-puro-cmv-nsp11可用于提高prrsv敏感性的細胞。三個基因不同的組合轉染到細胞中，對prrsv效價提升有不同程度的影響。其中nsp11可抑制宿主免疫，nsp2可以促進復制，nsp2/nsp11/cd151共表達可同時增強病毒吸附，較單一基因改造提升效價0.75-1.25?log10tcid50，篩選單克隆細胞可進一步提高收獲病毒效價。
18、本發(fā)明提供的基因工程改造細胞的方法可以應用于多種動物細胞，且可用于病毒致病機制與制備新型基因工程疫苗的研究。本發(fā)明的提出為豬藍耳病的防治提供了新的技術手段，為家畜病的疫苗研發(fā)開拓了思路，具有一定的現(xiàn)實意義。
19、在prrsv病毒感染細胞的過程中，細胞受體起著關鍵作用。受體cd151作為細胞表面四次跨膜蛋白，參與病毒吸附與侵入，對深入理解prrsv的感染機制具有重要意義。
20、傳統(tǒng)細胞馴化方法周期長、隨機性高。慢病毒載體可定向改造細胞，作為一種常用的基因傳遞工具，具有能夠高效感染多種類型細胞、可將外源基因穩(wěn)定整合到宿主基因組等優(yōu)點。在prrsv研究領域，慢病毒載體可用于將特定基因導入marc-145細胞，從而在細胞水平上深入研究這些基因對prrsv感染、復制以及細胞免疫應答等過程的影響。通過利用慢病毒載體構建相關的細胞模型，有助于進一步揭示prrsv與宿主細胞之間的相互作用機制，為開發(fā)針對prrsv的新型抗病毒策略，如設計更有效的疫苗、研發(fā)抗病毒藥物等提供理論基礎和實驗依據(jù)。
1.一種marc145細胞的改造方法，其特征在于，所述改造方法是采用慢病毒載體介導多基因共表達的方式改造marc145細胞，所述基因包含marc145細胞的cd151基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒prrsv的nsp2基因和nsp11基因，所述cd151基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述nsp2基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述nsp11基因的核苷酸序列如seqid?no.3所示。
2.一種采用權利要求1所述的改造方法改造的marc145細胞系。
3.一種擴繁prrsv病毒的方法，其特征在于，采用如權利要求2所述的marc145細胞系擴繁prrsv病毒。
4.一種權利要求2所述的marc145細胞系在研究病毒致病機制與制備新型疫苗中的應用。
5.根據(jù)權利要求1所述的marc145細胞的改造方法，其特征在于，所述慢病毒載體介導多基因共表達的方式包含以下步驟：
6.根據(jù)權利要求5所述的marc145細胞的改造方法，其特征在于，所述慢病毒載體為plv41tr-puro-cmv。
7.根據(jù)權利要求5所述的marc145細胞的改造方法，其特征在于，步驟s2所述包裝質粒為pspax2、pmd2.g。
8.一種如權利要求5所述的三個重組慢病毒質粒在提高病毒prrsv感染敏感性中的應用。