本發(fā)明涉及一種能夠使生物分子交聯(lián)以形成生物分子交聯(lián)的化合物的制備方法。具體而言，所述化合物與生物分子之間的交聯(lián)鍵是通過(guò)與交聯(lián)劑上的胺官能團(tuán)相互作用實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還涉及所述生物分子交聯(lián)的化合物及其衍生物。

背景技術(shù)：

1、納米材料技術(shù)的快速發(fā)展對(duì)生物傳感器領(lǐng)域的近期進(jìn)展作出了顯著貢獻(xiàn)1。納米顆粒(np)定義為小尺寸，并且它們通常由于其高表面體積比而展現(xiàn)出獨(dú)特性質(zhì)，其中高表面體積比在生物傳感器是有用的。原則上，生物傳感器依賴(lài)于分析物與生物傳感器上的生物識(shí)別元素，如酶-底物或抗原-抗體，的特異性相互作用2,3。因此，將生物分子固定于納米顆粒成為提高生物傳感器靈敏度與選擇性的有效策略4,5。目前已有多種生物分子功能化納米顆粒，例如碳納米管、金納米顆粒及其他金屬納米顆粒，被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域。例如，戊二醛為交聯(lián)劑，其可實(shí)現(xiàn)納米顆粒表面大量生物受體的包被。其可以與多種生物受體(例如蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì))結(jié)合，但是以一種不期望的非特異方式結(jié)合。美國(guó)專(zhuān)利第7226794b2號(hào)公開(kāi)了采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(sers)檢測(cè)生物分子的金納米顆粒(aunp)。此外，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)第1794590a4號(hào)則披露了利用單壁碳納米管固定碳納米管上生物分子的方法。

2、此外，二氧化硅納米顆粒(snp)為一類(lèi)備受關(guān)注的生物分子固定化無(wú)機(jī)納米材料。snp具備生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性及尺寸形貌可調(diào)控等特性9。snp可形成多種形態(tài)與結(jié)構(gòu)，例如常規(guī)無(wú)孔snp、介孔二氧化硅納米顆粒11,12、中空介孔二氧化硅納米顆粒13及核殼結(jié)構(gòu)二氧化硅14，從而呈現(xiàn)差異化性能。基于其多功能特性，snp已被廣泛應(yīng)用于藥物遞送、治療診斷等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域9,15,16。研究表明，氨基功能化snp具有生物相容性，適于作為藥物遞送載體。采用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(aptes)提供氨基團(tuán)，用于制備氨基功能化二氧化硅納米顆粒(afsnp)。在傳統(tǒng)方法中，通過(guò)縮合反應(yīng)在snp表面修飾aptes18-21。然而，該方法存在一些限制，例如官能團(tuán)數(shù)量不可控、儲(chǔ)存穩(wěn)定性有限及分子取向隨機(jī)等問(wèn)題，導(dǎo)致生物分子固定化效率降低。這最終降低了生物傳感應(yīng)用的靈敏度。

3、有多種固定化策略22,23；然而，它們可主要分為兩類(lèi)：非共價(jià)結(jié)合與共價(jià)結(jié)合。非共價(jià)結(jié)合依賴(lài)于靜電作用、疏水作用、極性作用以及親和相互作用，親和相互作用例如為生物素-親和素結(jié)合、組氨酸-金屬螯合、同時(shí)，共價(jià)結(jié)合涉及生物分子官能團(tuán)與材料表面，例如氨基、羧基、巰基、醛基或炔基，之間形成的化學(xué)鍵24。為實(shí)現(xiàn)生物分子在二氧化硅納米顆粒(snp)上的固定，需先對(duì)snp表面進(jìn)行功能化修飾，再引入snp與生物分子間的交聯(lián)劑。最常用的生物分子固定化交聯(lián)劑為戊二醛和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺/n-羥基琥珀酰亞胺(edc/nhs)25。然而，此類(lèi)交聯(lián)劑限制為它們僅能實(shí)現(xiàn)n端與c端之間的交聯(lián)。因此亟需開(kāi)發(fā)能通過(guò)其他功能化基團(tuán)相互作用，而僅僅有n端與c端之間的交聯(lián)，以實(shí)現(xiàn)生物分子在納米顆粒表面固定的方法，以拓寬基于該原理開(kāi)發(fā)的生物傳感器的應(yīng)用潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及一種能夠交聯(lián)生物分子的化合物或生物分子交聯(lián)的化合物的制備方法。具體而言，所公開(kāi)的方法采用一對(duì)相容性單體和共聚單體，通過(guò)單步反應(yīng)即可制得二氧化硅納米顆粒(snp)或化合物，較之傳統(tǒng)合成化合物的方法具有顯著簡(jiǎn)化特性。

2、本公開(kāi)的另一目的在于提供一種在相對(duì)溫和條件下制備二氧化硅納米顆?；蚱溲苌锏姆椒ǎ錅囟仍诖蠹s為室溫或略高于室溫的范圍。

3、本發(fā)明進(jìn)一步目的在于提供一種以受控方式制備生物分子交聯(lián)的化合物或生物分子交聯(lián)的二氧化硅納米顆粒的方法，該方法采用特定修飾的交聯(lián)劑，優(yōu)選通過(guò)功能化胺基團(tuán)，而非傳統(tǒng)的n端與c端相互作用，實(shí)現(xiàn)修飾或未修飾生物分子與化合物的交聯(lián)。

4、此外，本發(fā)明的另一目的為一種生物分子交聯(lián)的化合物，其中所述生物分子通過(guò)具有一對(duì)胺官能團(tuán)的交聯(lián)劑與所述化合物實(shí)現(xiàn)交聯(lián)，該對(duì)胺官能團(tuán)能夠結(jié)合所述化合物和生物分子。

5、本發(fā)明整體地或部分地實(shí)現(xiàn)前述至少一個(gè)目的，其中本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例為：一種生物分子交聯(lián)的化合物的制備方法。該方法基本包括以下步驟：在第一溶液中使多種單體與多種共聚單體在氨存在下反應(yīng)生成化合物；從第一溶液中提取所得化合物用于清洗；使清洗后的化合物與第二溶液反應(yīng)，通過(guò)交聯(lián)劑的第一胺官能團(tuán)將交聯(lián)劑連接至化合物；以及向第二溶液中加入多種生物分子，通過(guò)交聯(lián)劑的第二胺官能團(tuán)將生物分子與化合物結(jié)合，制得生物分子交聯(lián)的化合物。優(yōu)選地，所述單體為原硅酸四丙酯(tpos)、原硅酸四乙酯(teos)、原硅酸四甲酯(tmos)、原硅酸四異丙酯或原硅酸丁酯。優(yōu)選地，所述共聚單體選自(3-氨丙基)-三乙氧基硅烷)、(3-氨丙基)-三甲氧基硅烷)、(3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷)、(3-(二甲氧基甲基甲硅烷基)丙胺)、(3-氨丙基硅烷三醇)、(n-(2-氨乙基)(3-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷)或n-(2-氨乙基)(3-氨丙基)三甲氧基硅烷)。

6、根據(jù)某些實(shí)施例，所公開(kāi)的方法還包括：沉淀所制備的生物分子交聯(lián)的化合物，并將沉淀后的生物分子交聯(lián)的化合物分散于蒸餾水中。

7、根據(jù)某些實(shí)施例，所述單體與共聚單體的摩爾比為1.3-4.0：0.4-3.0。更優(yōu)選地，在其他實(shí)施例中，所述第一溶液包含溶解于蒸餾水與乙醇混合液中的氫氧化銨，其中蒸餾水與乙醇的體積比為1-10：20-30。

8、根據(jù)若干實(shí)施例，所述第二溶液包含衣康酸、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(edc)及n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，三者以15-35:60-90:30-60的摩爾比分散于水相中。

9、根據(jù)若干實(shí)施例，所述反應(yīng)步驟在20℃至40℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。

10、根據(jù)某些實(shí)施例，所述生物分子為帶有可結(jié)合交聯(lián)劑第二胺官能團(tuán)的氨基末端的抗原、抗體、肽鏈、dna或rna中的任一種。

11、本發(fā)明另一方面公開(kāi)了一種具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物分子交聯(lián)的化合物：

12、r1-x-r2

13、其中x為以下化學(xué)式的交聯(lián)劑：

14、(i)-hn-c(＝o)-ch2c(＝ch2)-c(＝o)-nh-或

15、(ii)-hn-c(＝o)-ch2c(＝ch2)-c-nh-。

16、優(yōu)選地，r1為二氧化硅納米顆粒，r2為帶有能夠結(jié)合交聯(lián)劑胺官能團(tuán)的氨基末端的生物分子。

17、在本發(fā)明化合物的若干實(shí)施例中，所述交聯(lián)劑通過(guò)將衣康酸、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)按15-35:60-90:30-60的摩爾比分散于水相中反應(yīng)制得。

18、在本發(fā)明化合物的若干實(shí)施例中，所述二氧化硅納米顆粒包括按1.3-4.0：0.4-3.0的摩爾比制備的單體與共聚單體。優(yōu)選地，所述單體為原硅酸四丙酯(tpos)、原硅酸四乙酯(teos)、原硅酸四甲酯(tmos)、原硅酸四異丙酯或原硅酸丁酯。優(yōu)選地，所述共聚單體選自(3-氨丙基)三乙氧基硅烷)、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷)、(3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷)、(3-(二甲氧基甲基甲硅烷基)丙胺)、(3-氨丙基硅烷三醇)、(n-(2-氨乙基)(3-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷)或n-(2-氨乙基)(3-氨丙基)三甲氧基硅烷)。

19、本發(fā)明另一方面為一種制備胺基功能化二氧化硅納米顆粒(afsnp)的方法，包括：在第一溶液中使多種單體與多種共聚單體在氨存在下反應(yīng)生成afsnp；以及從第一溶液中提取所得的afsnp用于清洗。優(yōu)選地，所述單體為原硅酸四丙酯(tpos)、原硅酸四乙酯(teos)、原硅酸四甲酯(tmos)、原硅酸四異丙酯或原硅酸丁酯，所述共聚單體選自(3-氨丙基)三乙氧基硅烷)、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷)、(3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷)、(3-(二甲氧基甲基甲硅烷基)丙胺)、(3-氨丙基硅烷三醇)、(n-(2-氨乙基)(3-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷)或n-(2-氨乙基)(3-氨丙基)三甲氧基硅烷)。

20、在所述制備afsnp方法的更多實(shí)施例中，所述步驟還包括：使清洗后的afsnp與第二溶液反應(yīng)，通過(guò)交聯(lián)劑的第一胺官能團(tuán)將交聯(lián)劑連接至所述化合物。優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑具有以下化學(xué)式：

21、(i)-hn-c(＝o)-ch2c(＝ch2)-c(＝o)-nh-；和/或

22、(ii)-hn-c(＝o)-ch2c(＝ch2)-c-nh-。